L’analisi molecolare consente di effettuare delle indagini sul DNA, per verificare la presenza di alterazioni (mutazioni) all’interno di una specifica regione genica di interesse.
“Target therapy” significa terapia mirata, cioè una terapia farmacologica che può agire in maniera specifica su un determinato bersaglio. Essa è importante perché permette di avere un’azione efficace solo sulle cellule tumorali e di non intaccare le cellule del tessuto normale.
E’ noto che il farmaco “mirato” per la cura dei GIST ha come “target specifico” la proteina C-KIT.
La scelta della terapia nella target therapy dipende dalla presenza o meno di mutazioni nel gene C-KIT poiché la risposta al farmaco varia in funzione della presenza o meno di alterazioni in questo gene.
I GIST sono tumori che possono essere curati in maniera mirata grazie all’uso di farmaci che agiscono direttamente a livello delle cellule tumorali, senza danneggiare i tessuti circostanti. Tutto ciò è dovuto al fatto che questa terapia mirata o “target therapy” ha un “bersaglio” specifico su cui può agire, che nel caso dei GIST è la proteina C-KIT.
La risposta al farmaco varia in base alla presenza o meno di alterazioni nel gene (C-KIT) che codifica per la suddetta proteina.
La ricerca di alterazioni genetiche viene effettuata in maniera totalmente non invasiva, poiché il materiale che viene utilizzato è una piccola porzione di tessuto tumorale asportato durante l’intervento chirurgico, incluso in paraffina dal quale viene estratto il DNA.
Le tappe dell’analisi molecolare sono le seguenti:
1. IL MATERIALE BIOLOGICO
E’ possibile analizzare lo stato mutazionale del gene C-KIT a partire dal DNA estratto da piccole biopsie esplorative o dal tessuto neoplastico asportato con l’intervento chirurgico. Il tessuto viene sottoposto ad una procedura detta “inclusione in paraffina”. Ciò permette di conservare il campione adeguatamente e per lunghissimo tempo. Solo pochissimi frammenti del tessuto paraffinato verranno utilizzati per effettuare l’analisi.
2. VALUTAZIONE DELL’ANATOMO PATOLOGO
Il tessuto neoplastico si presenta frequentemente come un tessuto eterogeneo, che comprende aree neoplastiche accanto a cui possono trovarsi anche aree di necrosi, aree flogistiche ed aree di tessuto normale. La possibilità di trovare mutazioni geniche risente della percentuale di cellule tumorali presenti nel tessuto e dunque della percentuale di cellule mutate presenti nel tessuto in analisi. E’ importante che tali caratteristiche vengano valutate dall’ Anatomo Patologo, il quale deve eventualmente provvedere a selezionare la parte di tessuto contenente un’adeguata componente di cellule neoplastiche, evitando così di selezionare anche componenti di tessuto normale o necrotico.
3. ESTRAZIONE DEL DNA
Questa fase dell’analisi consiste nella lisi delle cellule con conseguente rilascio del DNA in esse contenuto. A questo fine oggi si utilizzano dei kit di estrazione contenenti specifici tamponi di lisi che permetto di ottenere rapidamente un DNA purificato e pronto per le fasi successive di analisi.
4. AMPLIFICAZIONE DEL DNA
L’amplificazione del DNA è detta “Reazione di polimerizzazione a catena” (PCR). Questa è una metodica estremamente sensibile che consente una rapida amplificazione di una specifica regione di DNA su base enzimatica.
5. SEQUENZIAMENTO GENICO
Il sequenziamento automatico diretto consente la ricerca di mutazioni nel gene in esame precedentemente amplificato, nucleotide per nucleotide, cioè esso permette di conoscere in modo puntuale la successione di basi (sequenza) di un tratto genomico amplificato mediante PCR. La tecnica prevede l’utilizzo di apparecchiature automatizzate. Lo strumento (sequenziatore) effettua una vera e propria lettura della sequenza del gene di interesse, nucleotide per nucleotide, permettendo di discriminare ed evidenziare la presenza di eventuali mutazioni.
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